为什么要进行样品预处理？

• 1、首先是在硬件条件下，因为在过去几十年中，LC-MS或者LC-MS/MS已经成为小分子样品分析的标准检测手段，作为一种混合型分析仪器，LC-MS需要满足其两个组成部分的要求，首先液相色谱部分是用来分析液态样品的，流动相从溶剂瓶中流出经过高效液相色谱泵和进样阀，再进入色谱柱这是一个很长和精细的系统，所以要求进入色谱系统的样品必须是液态的，更重要的是没有颗粒，如果样品不是液态的，比如为组织样品和全血样品等，则需要处理成转换为液态，其次质谱部分是通过将液态转换为气态离子，并且在高真空条件下检测，以目前最常用的电喷雾离子化（ESI）和大气压化学离子化(APCI)两种离子源为例，为了确保有良好的离子化效率，要求进入的液态样品不能含有非挥发性酸碱或者盐。
• 2、另一方面是从我们要分析的样品特点出发，一个是样品太“脏”，这里的“脏”是指样品包含很多与目标物无关的物质，如蛋白质，细胞，盐类等，这些都不能直接进到LC-MS进行分析，比如蛋白质，在未经预处理时会在柱头析出导致色谱柱柱效迅速降低；同时“脏”还指样品中存在导致基质效应的物质，在质谱离子化的过程中基质成分会对目标物的离子化产生干扰（离子增强或者离子抑制），导致检测信号增大或者减小使得检测结果产生偏差。另外一个特定就是样品的浓度过低，或者低于目前拥有检测仪器的检测限，导致不能对样品进行检测分析，所以需要对样品进行预处理进行富集（预浓缩样品），最后就是样品的稳定性，有些目标物易被氧化，还原或者降解，所以预处理需要考虑这个因素，加入保护剂避免在分析过程中目标分析物的转化分解。

生物样品预处理方法有哪些？有什么特点？

① 稀释法

• 稀释是最简单的样品预处理技术，也常被称为“稀释和进样”，这也是一种兼容性很强的方法，几乎所有分析物均有100%的回收率，缺点是没有选择性，使用该方法时，样品只需要用LC-MS兼容的溶剂稀释，但是样品中所有组分都会进入LC-MS系统。稀释法只适用于基质效应不大且不存在灵敏度问题的情形下，如不含有或者仅含有很少大分子的简单液体基质（尿液，泪液，脑脊液等），不适用于含有蛋白质或者脂质的复杂生物分析。

• 优点：样品处理的操作少，回收率100%，耗时和成本低。

• 缺点：样品稀释后信号显著下降，不适应于原本浓度较低的样品，基质效应比较明显。

②蛋白质沉淀法

• 由于生物样本中血浆和血清是最为常见的类型，其含有丰富的可溶性蛋白，需要更复杂的预处理，而通过加入有机溶剂，酸碱盐等溶剂可以有效的沉淀去除生物样品中大部分的蛋白质的过程被称为蛋白沉淀法，因此蛋白沉淀是目前生物分析中应用最多的预处理方法。
• 优点：几乎适用于任何极性的小分子化合物，快速（适用于自动化和半自动化操作），回收率100%。
• 缺点：
  • ①基质效应，PPT处理后的样品含有全部的内源性小分子（无选择性），质谱离子化可能受到干扰产生明显基质效应。
  • ②容易误取蛋白以及耗时，采用EP管一个一个的处理，一次离心24个，总耗时约30分钟/24个。除了操作耗时的问题，同时还存在离心不完全、容易误取蛋白、基质效应、操作耗时、难以批量的问题。
    

蛋白沉淀板的原理是利用内嵌的筛板

• 1、有效的保持沉淀剂不滴漏
• 2、有效的过滤沉淀后的蛋白。采用蛋白沉淀板进行蛋白沉淀
  共4步
  
  除了操作省时的优势外，还同时具有快速高通量、无溶剂泄露、无交叉污染、超长溶剂保持时间等优势。同时，由于膜（筛板）是特殊加工过的，因此对待测物吸附很低，特别是对一些亲脂类物质！

③ 液-液萃取法

• 液-液萃取（LLE）是生物分析中另一种常见的样品预处理技术，LLE的原理是基于目标分析物在互不相溶的溶剂之间的脂水分配系数（LogP）不同，将化合物从水相萃取到与水不相溶的有机相中（对于离子型的化合物可以通过调节PH或离子强度至合适范围使之形成分子态），常用的有机溶剂有甲基叔丁基醚（MTBE）,乙酸乙酯，正己烷，1-氯代正丁烷等。通过LLE可以有效的将目标化合物从水相萃取到有机溶剂中，而将大部分基质组分（如磷脂，蛋白质，无机盐等）留在水相中，提取的样品更加干净和简单，因此LLE相比PPT是一种选择性更强的样品预处理技术。
  
• 非常适用于非极性至中等极性的分析物，可以起到富集浓缩效果，能降低基质效应，成本低，方法易转移，开发时间较短。
• 缺点：不适用于亲水极性物质，操作中易污染，耗时较长。

④ 固相萃取法(SPE)

• 固相萃取是将生物样品上样至键合固定相吸附剂的SPE小柱/提取板/提取柱上，目标分析物通过不同的作用机制与键合相发生相互作用后被保留，干扰基质可能在上样的过程中直接流过吸附剂，在淋洗时被洗脱或者仍然保留在固定相中，而目标化合物则被保留在固定相中，选用合适的洗脱液洗脱出来后，进行LC-MS分析。根据填料的不同，SPE主要分为三种类型，反相SPE;正相SPE和离子交换SPE（还有基于以上模式的混合型SPE），通常固相萃取法(SPE)适用于目标物浓度很低的痕量样品，基质效应严重或者目标物化合物难于分离的生物样品。
  
• 优点：适用于极性到非极性多种类型化合物，可自动化操作，可富集痕量样品分析。
• 缺点：操作繁琐，耗时长，成本高，需要丰富的操作技巧和分离科学知识。

⑤ 免疫亲和萃取法（IA-SPE）

• 免疫吸附剂是将分析物专属抗体固定于固相载体的一种选择性提取材料。当免疫吸附剂暴露于含有目标分析物(抗原)的样品中时,分析物和固定的抗体之间会发生具选择性的可逆的抗原-抗体结合。利用免疫吸附剂提取目标分析物的方法称为免疫亲和(IA)提取.将免疫吸附剂填充于 SPE提取板或小柱上进行样品预处理的方法称IA-SPE, 免疫提取SPE 的操作步骤可分为4步:活化、样品渗透、淋洗和洗脱。
  
  • 活性：活化这一步是为了建立适合分析物和抗体作用的环境。免疫吸附剂一般储存于含有少量叠氮化物的磷酸缓冲液(PBS)中,以保持抗体活性。可以使用能使目标分析物和抗体发生相互作用的溶液换该缓冲液.
  • 上样: 将预处理后的生物样品上样或者和免疫吸附剂一起温孵。这一步必须充分考虑免疫吸附剂的容量以避免吸附剂过载。
  • 淋洗: 这一步是为了除去通过特异性吸附（NSB）于吸附剂上的干扰化合物,这些NSB有疏水性的和离子间的相互作用。类似常规SPE的操作,淋洗液需要有效去除干扰物质,但同时不破坏抗原-抗体的相互作用。
  • 洗脱: 任何能有效破坏分析物和抗体间作用力的溶液,如置换剂、离液剂、pH调节剂、有机溶剂等,均能用来洗脱分析物和内标。
• 优点：是五种方法中选择性特异性最高的，具有高灵敏度、重现性好，适用于具有顽固干扰和其他预处理手段不能解决的蛋白质核酸的大分子方法开发。
• 缺点：操作繁琐，耗时长，成本非常高昂。

在项目的方法开发中如何选择最佳的预处理方法？

• 首先对于目标分析物，应该尽可能的掌握其目标化合物的相关理化性质，如脂水分配系数LogP,酸碱度PKa,溶解度，蛋白质结合率，化学稳定性等，在实验之前花点时间去关注这些性质，对于选择预处理技术的适用性和实验条件的选择是至关重要的。
• 同时不同的基质组成（血浆，血清，全血，尿液，脑脊液和各种组织样品）和复杂程度（基质的PH，蛋白质和脂质性质和浓度，盐的含量）都是明显不一样的，了解分离的基质是选择预处理的关键因素之一。
• 例如，在处理全血样品时，化合物在血浆和红细胞之间的分布，化合物在全血中的酶稳定性，血浆蛋白结合率的差异都要考虑，当分析物明显存在红细胞内时，预处理方法就需要通过物理或者化学手段将分析物从红细胞中释放出来，同时还要平衡优化带来的溶血基质效应的不良结果。
• 对于实验工具你需要了解其性能和选择，根据实验要求和检测限选择合适的质谱平台，还有许多看似不起眼的细节往往也是生物定量分析中至关重要的的步骤。
• 例如对于那些尿液样品，玻璃材质的离心管的会产生非特异性结合（NSB），这时候就要考虑更换为聚丙烯材质的低吸附管来解决，移液前的样品装的太满导致混合不均匀，所以要求液体的混合体积最好不要超过体积的二分之一，样品处理和液体转移时的交叉污染，移液装置的液体残留等，要做好操作人员的培训，另外也可以考虑应用液体工作站这样的自动化工具，同时对于复杂的分析方法要平衡好人工操作和自动化工具的利弊，人工操作成本低但是存在操作误差和重现性不佳带来的项目实验失败率的较高的风险，而自动化处理具备更好的精密度，减轻重复操作给人带来的压力和疲劳但是成本较高，这都需要把这些因素考虑在内。
• 最终的生物分析策略应该是项目所需要的技术能力和实验成本（时间，金钱和其他资原）之间的综合评估的结果，例如一个不要求高灵敏度的分析项目可以通过简单的稀释来执行，一次性的小实验可以用PPT，但如果建立的分析方法用来支持多个研究项目并且样品量大时，该方法必须非常耐用，只要最终每个样品的分析成本可以接受，不必太在意最初方法开发和验证时的成本。综上，最佳的生物分析策略时满足项目需求的最经济的策略。

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