蛋白质不稳定性可以分为两类：化学不稳定性和物理不稳定。化学不稳定涉及形成或断裂共价键，从而产生新的化学实体。物理不稳定性包括变性、聚集、沉淀和吸附，沉淀一词用于表示不溶性，而不是形成的不可溶性团聚体。

1. 去酰胺化

脱酰胺反应也就是蛋白质结构中的天冬酰胺和谷氨酰胺侧链酰胺的水解是蛋白质和肽类的常见降解途径。例如单克隆抗体，人类生长激素（hGH），胰岛素、γ-球蛋白和血红蛋白都存在去酰胺化现象。

天冬酰胺残基的脱酰胺作用是由天冬酰胺侧链酰胺直接水解形成的，在中性至碱性溶液（即pH值高于6）中，该机制转变为一个分子内环化反应。第一步涉及蛋白质主链上n+1氮原子对酰胺基团的亲核攻击(见图1)。由于氨基或部分去质子化的酰胺氢使得氮原子更具亲核性，从而加速了反应，这一步是由碱催化的。形成了一种环状亚胺（也称为琥珀酰亚胺或天冬酰胺），同时损失氨气。由于氨是一种气体，在溶液中通常不会被保留，所以此步骤实际上是不可逆的。虽然琥珀酰亚胺中间体本身经常作为降解产物而被检测到，但它在水溶液中很容易被水解为天冬氨酸和异天冬氨酸。形成五元环状琥珀酰亚胺中间体被认为是天冬酰胺肽酶活性比谷氨酰胺肽酶更强的原因，因为五元杂环比与谷氨酰胺肽酶相关的六元环更加稳定。

蛋白质中的天冬酰胺-甘氨酸特别容易发生去酰胺化，首先，在天冬酰胺残基之后具有较小侧链的氨基酸会导致更快的去酰胺化，这可能是因为最初的环化反应没有位阻。其次，继天冬酰胺残基后接的具有可以作为氢键供体的侧链的氨基酸倾向于加速该反应，可能是因为天冬酰胺羰基氧上的分子内氢键使其更具电性，从而更容易受到亲核攻击。且只有那些紧随其后的是小分子或氢键供体（例如丝氨酸、天冬酰胺或天冬酸）残基的天冬酰胺残基表现出脱酰胺作用。

2. ASP异构化

去酰胺化过程中一旦中间体环状酰亚胺形成，它可以生成天冬酰胺或异亮氨酸。这个反应被称为天冬酰胺异构化。许多文献报道天冬酰胺异构化，尤其是在单克隆抗体中使用了LC-MS方法监测天冬酰胺异构化。在单克隆抗体中观察到了这两种降解途径。具体来说，对于单克隆抗体中的天冬酰胺-天冬酰胺序列在第32位观察到天冬酰胺异构化，在轻链和重链中的第102位。观察到天冬酰胺异构化和天冬酰胺辅助水解。

3. ASP水解

与丝氨酸/天冬酰胺残基降解相关的第三个反应是天冬酰胺相关肽键水解（也称为蛋白酶水解）。即使没有天冬酰胺存在，抗体中也观察到了肽链的水解。这种反应最常发生在抗体的铰链区，因此被称为铰链区水解。它也可以发生在 CH2-CH3 之间，通常在在四种不同的IgG1中也发生，因此该反应很可能是由多肽链的柔韧性影响的。经研究水解反应在肽键上不具有特异性，而是在一组狭窄的残基范围内。在这种情况下，水解仅限于重链序列丝氨酸-半胱氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-苏氨酸-组氨酸-苏氨酸。虽然链的柔韧性似乎很重要，但Fab区域构象的不稳定会导致铰链区水解速率加快。铰链区水解的pH速率曲线呈“V”形，在pH约为6时有最低值，高于6时，速率随pH线性增加。

除了这些更常见的降解过程外，其他功能团也对水解敏感，例如，色氨酸侧链会发生水解。主要降解产物被称为犬尿氨酸，其荧光波长比色氨酸本身长得多（450nm）。犬尿氨酸和相关物质也可以在氧化分解色氨酸时形成。

4. 手性化和β消除

手性化和β消除这两种降解途径是相互关联的，因为第一步是相同的：脱除α-碳上的质子（图 2）。通常，C-H 键几乎没有酸碱反应性，但氨基酸的 C-H 键确实具有一定的酸性。因此，外消旋化通常是缓慢的过程，非常缓慢，可以用来测定物质的年代。当Cα-H键被电离后，重组可以导致手性反转。另一方面，产生的碳负离子可能会重新排列并从β位点移除离去基团，从而在α和β位点之间产生双键。这是β消除。在高温下，在许多蛋白质中似乎很容易发生Cys残基的β消除。如IL-1ra和胰岛素的β消除。在引起铰链区域水解的情况下也会发生β消除。

5. 二酮哌嗪（DKP）环的形成

当蛋白质或肽链的N-末端为甘氨酸（Gly）并且紧随其后的氨基酸为脯氨酸（Pro）时，这样的序列（NH2-Gly-Pro）在特定条件下容易形成二酮哌嗪环。在较高的pH值（通常pH > 8）下，末端氨基（NH2）会质子化，成为较强的碱性基团，这使得它更容易参与反应。这种条件下，末端氨基可以攻击第二个氨基酸（在这里是脯氨酸）的羰基碳原子，引发环化反应。当末端氨基攻击脯氨酸的羰基时，会形成一个临时的中间体。这个中间体会进一步重排形成一个稳定的五元环——二酮哌嗪环（DKP），一旦形成，DKP环非常稳定，不易逆转，因此会导致蛋白质或肽链的N-末端序列发生永久性的改变。这种改变可以影响蛋白质的活性、稳定性以及与其他分子的相互作用。

6. 谷氨酸磷酸盐的形成

这种反应涉及 N 端氨基对谷氨酸侧链（偶尔是对天冬酰胺侧链）的亲核攻击，形成五元环结构。换句话说，非酶介导的吡咯谷氨酸（pGlu）的生成遵循与二酮磷酸生成类似的机制，即N端氨基对多肽链的亲核攻击。在这种情况下，攻击位置是N端谷氨酸侧链的羰基，导致水的消除。在这种闭环、N 端结构在单克隆抗体中很常见，因为在轻链的第一位点谷氨酸的频率很高，偶尔也会出现在重链中。重链通常情况下，使用质谱技术检测到 pGlu的存在，在长期储存单抗后，pGlu水解产物增加。

7. 蛋白质糖基化

当蛋白质在还原糖的存在下被孵育时，会发生糖基化。这涉及到碱性反应，通常是非必需氨基酸赖氨酸侧链和还原糖羰基的一次加成。糖基化通常涉及赖氨酸残基，尽管精氨酸残基和N端也可能参与。尽管已经证明糖基化不会影响某些抗体的亲和力。但是，它可以影响分子的整体稳定性。

8. 氧化降解

任何含有His、Met、Cys、Tyr和Trp氨基酸的蛋白质都有可能被多种活性氧物中的任意一种氧化而损害。这些活性侧链在蛋白质中的氧化可以在蛋白质合成、纯化、制剂和储存的任何阶段发生。氧化速率受内在和外在因素的影响。内在因素包括肽键的柔韧性和蛋白质的整体结构。此外，诸如pH和缓冲液类型等外在因素也可以影响蛋白质的氧化速率。

9. 氧化还原反应

甲硫氨酸肽键的化学稳定性对于构象稳定性和蛋白质功能至关重要。与水解反应不同，甲硫氨酸氧化似乎几乎不受pH影响。因此，无法通过调节pH来控制氧化。甲硫氨酸氧化可以由多种ROS介导。甚至分子氧也足以将甲硫氨酸侧链转化为相应的亚砜。在水溶液中与氧气发生反应涉及氧气在水中溶解度随温度降低而增加的温度依赖性。虽然甲硫氨酸氧化通常遵循阿伦尼乌斯行为，但反应活性实际上可能会因低温下氧气的溶解度高于室温而增加。由于这些反应是由自由基传递的，所以必须认识到自由基可能来自许多潜在来源包括容器和辅料。这种氧化也发生在单抗中的甲硫氨酸残基氧化，尤其是 Fc 区域中的甲硫氨酸残基。

10. 金属催化氧化

当一个氧化还原活性金属结合到蛋白质时，就会发生金属催化氧化。配体通常是甘氨酸、天冬酰胺、组氨酸和半胱氨酸。其中，组氨酸和半胱氨酸对氧化损伤敏感。

11. 色氨酸氧化作用

即使在没有光照的情况下，色氨酸残基也可能被氧化。主要产物是吡咯酮衍生物（尤其是当使用铁基氧化剂时）。高液相色谱 (SEC) 和反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 色谱图中观察到单克隆抗体中的色氨酸氧化出现新的峰。

12. 半胱氨酸氧化

半胱氨酸残基涉及的主要氧化过程是二硫键的形成，但它们也会受到其他氧化过程的影响。例如，它们可以形成磺酰基化合物，这与甲硫氨酸被氧化为亚砜的方式非常相似。

13. 光氧化作用

当蛋白质暴露于光下时，会引起对光氧化敏感的氨基酸发生化学氧化的行为，这些氨基酸包括色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。光诱导氧化反应途径始于一个光子被吸收并使电子进入激发态。从激发态开始，氨基酸具有多种降解途径生成不同的产物。在四种氨基酸中，色氨酸对大于300nm的光最敏感，因为它在这两种波长下吸收了大部分的光。当色氨酸通过吸收近紫外光被激发时，它可以影响邻近的氨基酸，并在此过程中减少二硫键。色氨酸的光电离可以通过电子转移来减少二硫键，从而导致蛋白质发生化学和物理降解。对不同蛋白质的研究表明，激发态色氨酸具有在液相和固态基质中降低二硫键的能力。

14. 二硫键重排

半胱氨酸残基形成二硫键的能力已经是众所周知。虽然它们可以通过共价交联在聚集中发挥重要作用，但它们也可以影响蛋白质的整体构象，就像分子内现有二硫键重新排列时所发生的情况一样。去除游离的半胱氨酸(还原形式)，可以显著减缓这一过程。

15. 热变性

变性指的是蛋白质丧失天然构象和三维结构被破坏，在变性或去折叠后，蛋白质改变了它的物理状态，但化学成分保持不变，变性可能涉及二级或三级结构的丧失。热诱导变性通常是非可逆性的，因为未折叠的蛋白质分子会迅速聚集形成聚集体。这种行为在使用差示扫描量热法进行热变性研究时经常观察到。

16. 冷变性

蛋白质在常见稳定剂如糖的存在下，最大冷冻浓缩状态下的玻璃化转变温度(Tg')通常远低于-20℃。这意味着蛋白质在这种冷冻状态下具有与流体溶液相似的流动性。因此发生冷变性的可能性很大。

17. 化学变性

化学诱导变性导致蛋白质结构被破坏，常用的物质如尿素和盐酸胍。尿素会阻止蛋白质的疏水折叠，导致蛋白质的化学势降低，这种状态下的蛋白质会发生变性。

18. 压力诱导变性

在2000-4000个大气压下，会使折叠态的蛋白质展开导致蛋白质变性，一般来说一定压力下导的变性是完全可逆的。

19. 固体状态下的变性

蛋白质在高温下会变性，即使是在固体状态下。变性温度Tm 值与玻璃态转变温度和水分含量成正比。。例如，对于人生长激素来说，只有当温度高于玻璃态转变温度时才会发生变性，而且是协同作用，大部分都是不可逆的。

20. 表面吸附

吸附本身就是一种物理不稳定性，因为它改变了蛋白质的物态。然而，界面应力引起的后续损伤更为严重。在水溶液中蛋白质会吸附到各种表面上。例如亲水性细胞因子白介素-2会吸附到玻璃上，IgG1与塑料结合，BSA和其他蛋白质一样，也表现出一些倾向于不锈钢结合的倾向。因为当蛋白质的疏水区域在接触非极性或疏水性表面时，会倾向于与这些表面发生相互作用。这种作用力可能导致蛋白质分子内部的疏水残基暴露出来，促使蛋白质结构发生变化，有时甚至导致蛋白质的局部或完全展开。当蛋白质吸附到表面时，蛋白质周围的水分子会被释放，这增加了系统的熵。为了最大化熵增益，蛋白质可能会调整其构象，以减少水合层并更紧密地贴合表面。在吸附过程中，蛋白质可能会受到来自表面的机械应力，尤其是当蛋白质被压缩或拉伸时。这种外力可能导致蛋白质的二级和三级结构发生改变。

21. 冰水界面破坏作用

关于冰-水界面对蛋白质的破坏作用最早的报道出现在上世纪90年代，蛋白质损伤的程度与冰的表面积有关，冰-水界面对蛋白质的破坏作用主要发生在冷冻和解冻的过程中，尤其是在快速冷冻和缓慢解冻的条件下。当水溶液冷冻时，水分逐渐转化为冰晶，这导致溶液中未冻结水的浓度增加，形成所谓的浓缩效应。这意味着在室温下可能足以稳定蛋白质的稳定剂的量，在较低的温度下可能不足。蛋白质分子在这种浓缩的环境中容易聚集和沉淀，因为它们被迫进入更小的空间内。形成的冰晶可以对蛋白质分子产生物理挤压，尤其是在缓慢冷冻过程中形成的大冰晶。这些冰晶的尖锐边缘可以撕裂蛋白质的三维结构，导致蛋白质变性。冰晶的形成导致蛋白质周围的水分子被移除，这会破坏蛋白质的水化层，使蛋白质分子直接暴露在更浓缩的溶质环境中，从而引发构象变化和聚集。在冷冻过程中，随着水转化为冰，溶液中的盐分和其他溶质的浓度增加，这可能导致蛋白质的盐析作用，即由于高盐浓度而引起的蛋白质沉淀。解冻时，冰晶重新融化并可能再次形成，这一过程可能会进一步损伤蛋白质的结构。特别是在反复冻融循环中，蛋白质的损伤会累积。

22. 空气水界面

当蛋白质接触到空气-水界面时，其表面的疏水性区域倾向于朝向空气，而亲水性区域则倾向于留在水中。这种构象变化可能导致蛋白质部分或全部展开，从而影响其稳定性和功能。蛋白质可以降低空气-水界面的表面张力，这是因为蛋白质分子占据了一部分界面，减少了水分子间的氢键网络，从而降低了表面张力。但是，这种作用也可能使蛋白质处于不稳定的状态，因为它需要克服水的表面张力才能展开并吸附于界面。蛋白质分子在空气-水界面的稳定性还受到分子间相互作用的影响，包括氢键、范德华力、静电相互作用和疏水相互作用。这些相互作用可以稳定蛋白质的构象，但也可能导致蛋白质聚集或沉淀。在空气-水界面，蛋白质可能更容易受到氧气和光线的影响，导致氧化和光降解，从而影响其稳定性。

23. 震荡与盐效应

震荡是指外部施加的机械振动或摇动。蛋白质在震荡下的响应依赖于震荡的强度、频率以及蛋白质本身的性质。强烈的震荡可能会导致蛋白质的构象发生变化，这可能包括蛋白质的局部或整体展开，从而影响其功能。振荡可以破坏蛋白质的二级结构（如α螺旋和β折叠），导致蛋白质失去其天然的三维结构。振荡可能会促使蛋白质分子之间相互碰撞，增加蛋白质聚集和沉淀的可能性。振荡造成的机械应力可能破坏蛋白质的活性位点，导致酶活性降低或其他功能受损。盐效应还可以影响蛋白质的稳定性、构象和功能。例如，盐离子可以改变蛋白质的电荷分布，影响蛋白质与其他分子的相互作用，包括配体结合和酶底物的识别。在一些情况下，适当的盐浓度可以稳定蛋白质的结构，而在其他情况下，高盐浓度可能会导致蛋白质的结构破坏和功能丧失。

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